華南理工大學食品科學與工程學院的肖 寒、劉秀妨、黃明濤*等在國內外最新研究進展的基礎上，對溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶的結構特征、水解機理、生產現狀和實際應用等進行歸納總結，并對其未來的研究方向進行展望，以期能夠為微生物源膠原蛋白酶的進一步開發和利用提供參考依據。
1、微生物源膠原蛋白酶結構特征
微生物源膠原蛋白酶通常具有多個結構域（圖2），分別是前肽、激活結構域、肽酶結構域、PKD和CBD。按照其功能又可將激活結構域和肽酶結構域歸為催化功能模塊，將PKD和CBD歸為膠原募集模塊。膠原募集模塊的差異也是不同菌種來源的膠原蛋白酶在結構差異性上的重要體現。
膠原募集模塊中的CBD可特異性地識別結合膠原蛋白的三股螺旋結構，是膠原蛋白酶水解不溶性天然膠原蛋白的重要結構，其傾向于結合在膠原蛋白三股螺旋較松散的部分。PKD與膠原蛋白的結合不緊密，但可以進一步強化CBD與纖維狀膠原蛋白的結合能力。如圖3所示，ColG含有兩個串聯CBD和一個PKD，Ca2+的存在可以使ColG中兩個CBD之間的連接部分由α-螺旋轉變為β-折疊，增強CBD與膠原蛋白的結合，也使其不易被其他蛋白酶水解，提高了全長膠原蛋白酶的穩定性。ColH含有一個CBD和兩個PKD，CBD可以沿著膠原蛋白纖維滑動，找到更容易水解的位點，兩個PKD的存在使其對膠原蛋白的親和力更強。根據這一結構特征，二者可協同水解膠原蛋白，即ColG先錨定在膠原蛋白纖維最脆弱的區域使原纖維溶脹，ColH結合在這些溶脹的區域進行水解
2、膠原蛋白酶的水解機理
2011年，Eckhard等首次對膠原蛋白酶ColG進行整體晶體結構解析，并通過分別異源表達該酶各個結構域推測其水解膠原蛋白和微原纖維膠原蛋白（由5 條三股螺旋纏繞而成）的機理，大致分為以下3 個步驟，如圖4所示。
首先膠原蛋白酶的肽酶結構域與膠原蛋白三股螺旋結合（圖4A）；此時膠原蛋白酶處于開放狀態，激活結構域未與底物相互作用，膠原蛋白尚未發生水解；隨后膠原蛋白酶閉合，激活結構域與三股螺旋發生相互作用（圖4B）。水解過程中，膠原蛋白酶漸漸打開成半開放構象，使3 個α-鏈解旋并依次降解（圖4C）。在三股螺旋被徹底水解后，膠原蛋白酶便恢復至初始開放狀態，進行下一輪水解。對于由5 條三股螺旋纏繞形成更為復雜的微原纖維膠原蛋白，水解步驟也大致相同，但每次只水解一個三股螺旋膠原蛋白，其余部分被排到酶外等待下一次水解（圖4D～F）。
3、膠原蛋白酶活力檢測方法
膠原蛋白酶的酶活力檢測方法主要有平板法、顯色法和熒光法等。
平板法可用于初步篩選具有膠原蛋白水解活性的菌株。具體方法是將具有膠原蛋白酶活性的菌株在明膠平板上進行培養后，用酸性汞試劑處理平板，未被降解的明膠變性沉淀，可觀察到菌落周圍出現水解圈，通過水解圈與菌落直徑比值的大小可以初步判斷該菌株分解膠原蛋白能力的強弱。該方法操作簡便，可用于初步鑒定膠原蛋白酶水解活性，但是水解圈大小根據觀察時間不同而有所區別，且靈敏度較低，多用于定性檢測。
顯色法中，茚三酮顯色法是一種常規的膠原蛋白酶酶活檢測方法，通過酶水解底物釋放至體系中游離氨基酸的含量來表征膠原蛋白酶的水解活力。該方法通常以可溶性膠原蛋白、不溶性膠原蛋白和變性膠原蛋白明膠等作為底物，以甘氨酸或亮氨酸的生成當量來定義酶活力單位U。
除了以天然或變性膠原蛋白為底物，一些人工合成的特異性底物也常用于膠原蛋白酶活力的檢測，如Azocoll、FALGPA（N-(3-[2-furyl]acryloyl)-L-leucylglycyl-L-prolyl-L-alanine）和Pz-PLGPA（PZ-L-prolyl-L-leucyl-glycyl-L-prolyl-D-arginine）等。Azocoll是一種與偶氮染料連接的膠原蛋白，被膠原蛋白酶水解后染料釋放，可通過測定520 nm波長處吸光度來計算酶活力。FALGPA和Pz-PLGPA是人工合成的膠原蛋白酶寡肽底物，不易被其他蛋白酶水解。
除了這些常見的底物，Saikumari等合成了一種新的熒光底物，能專一地被溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶切割而不受其他蛋白酶影響，該底物水解后受336 nm激發光激發后，在490 nm波長處的發射熒光顯著增強，反應快速靈敏。Go等利用鄰苯二甲醛（OPA）與游離氨基酸結合產生熒光的特點，在膠原蛋白酶與底物反應后的反應液中加入質量濃度1 mg/mL OPA（0.1 mol/L PBS，pH 7.4），被360 nm激發光激發后，檢測460 nm波長處的熒光強度。此類方法快捷靈敏，能在較短的時間內獲得大量數據，但熒光試劑通常較為昂貴，檢測成本較高。
4、膠原蛋白酶生產現狀
發酵生產
目前商業化的膠原蛋白酶主要來自溶組織梭狀芽孢桿菌，通過培養溶組織梭狀芽孢桿菌再從其培養上清液中分離純化所需的膠原蛋白酶。該方法的優勢在于溶組織梭狀芽孢桿菌將膠原蛋白酶分泌到培養基中，可以在簡單的液體培養基中大量培養，獲得膠原蛋白酶的效率較高。但該方法所得的膠原蛋白酶粗制劑中還含有棕色色素、梭菌蛋白酶、氨基肽酶和幾種中性蛋白酶。梭菌蛋白酶的存在導致粗酶制劑會對成骨細胞和胰島細胞產生細胞毒性，也會導致純化后期和貯存運輸過程中膠原蛋白酶的降解。上清液中其他酶類以及多種C末端截短的膠原蛋白酶的存在增加了膠原蛋白酶分離純化時工藝的難度，且容易造成不同批次的膠原蛋白酶粗制劑活性差異較大。目前，研究人員主要從優化溶組織梭狀芽孢桿菌的培養基和改進純化方式兩大方面著手提高膠原蛋白酶的純度。
異源表達
為獲取較高純度的膠原蛋白酶，以便進一步對膠原蛋白酶的生化性質、酶結構、催化機理、構效關系展開研究，同時拓展其在生物技術和醫學等領域應用，研究人員嘗試通過基因工程的手段重組表達生產膠原蛋白酶。目前相關研究已經在不同的表達體系中開展，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和產氣莢膜梭菌等。
5、膠原蛋白酶的實際應用
生物醫藥
膠原蛋白是細胞外基質和結締組織中的主要結構蛋白，其異常的合成和積累常常會導致纖維化相關疾病，因此，在生物醫藥領域常采用注射膠原蛋白酶的手段治療相關疾病，如腰椎間盤突出、掌筋膜攣縮和佩羅尼病等。掌筋膜攣縮是掌腱筋膜中膠原蛋白的沉積導致掌指關節發生攣縮，使手指的正常功能受損的疾病，多發于中老年男性。2010年2月美國食品藥品監督管理局（FDA）批準了溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶用于掌筋膜攣縮的非手術療法。膠原蛋白酶注射療法與掌筋膜切斷術等手術療法相比具有副作用更少、作用溫和、患者滿意度高等優勢。
食品加工
在食品工業中，使用酶來輔助食品加工是常見的方法，它可以提高食品的營養和功能特性。在膠原蛋白酶的作用下，膠原蛋白被水解成膠原蛋白肽。研究表明攝入膠原蛋白肽可能有助于機體合成膠原蛋白，具有多種健康益處，如改善皮膚健康、減緩關節疼痛和預防骨質疏松等。Yang Xinghao等利用膠原蛋白酶水解魚骨、魚皮、魚鱗等海產品副產物，發現水解物具有較高的抗氧化活性。Song Yihang等利用重組膠原蛋白酶水解牛骨膠原蛋白，通過響應面法優化水解條件，使用質量濃度110 μg/mL的膠原蛋白酶在35 ℃、pH 8條件下制得可溶性膠原蛋白肽，并從中鑒定出5 種新型抗氧化肽。
結 語
溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶可高效水解膠原蛋白，在生物醫藥、食品加工等行業得到了廣泛應用，是最具代表性的微生物源膠原蛋白酶。目前，對溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶的組成和結構已有了較為清晰的認識，同時該酶也在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和產氣莢膜梭菌中實現了異源表達，但是仍然有以下問題有待解決。
在分泌機制方面，膠原蛋白酶在溶組織梭狀芽孢桿菌中的具體分泌機制未知，前導肽的具體功能作用及ColG和ColH分子截短形式的產生機理有待研究。在酶產量方面，針對純化標簽對膠原蛋白酶活力的影響以及蛋白產量低等問題，可通過選擇不同的表達體系（如嘗試真核表達體系：釀酒酵母或畢赤酵母等），并對異源表達體系進行代謝途徑改造來進一步提高生產效率。在實際應用方面，為提高膠原蛋白酶的穩定性和生物利用度，還可通過包埋法、吸附法和共價結合法等對膠原蛋白酶進行固定化。在酶學性質拓展方面，可利用計算機輔助設計進行酶工程化改造提高酶活力、穩定性和底物特異性等。此外，由于膠原蛋白酶為模塊化酶，可對不同膠原蛋白酶的優勢模塊進行交換，獲取更具有優勢的膠原蛋白酶。
本文《溶組織梭狀芽孢桿菌膠原蛋白酶的研究進展》來源于《食品科學》2022年43卷17期316-325頁，作者：肖寒，劉秀妨，鄭淋，趙謀明，黃明濤。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210830-385。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。
修改/編輯：袁藝；責任編輯：張睿梅
