近日，中國科學院昆明植物研究所黃勝雄課題組解決了長期遺留的可卡因托品烷骨架構建的世紀難題，再次闡明了經典的Robinson托品酮全合成是仿生合成，相關研究成果以“Discovery and Engineering of the Cocaine Biosynthetic Pathway”為題發表在Journal of the American Chemical Society（https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c09091）上。
正文
托品烷生物堿（tropane alkaloids）是一類由吡咯環和哌啶環駢合為托品烷基本骨架的生物堿，代表性成員莨菪堿和可卡因是具有悠久的藥用歷史，且目前仍在臨床上廣泛使用的重要天然藥物。莨菪堿作為毒蕈堿型乙酰膽堿拮抗劑，用于鎮痛、止痙攣、治療帕金森癥等；可卡因作為第一個被發現的局部麻醉藥，衍生出臨床上現今絕大多數的麻醉藥，成為了藥物化學中麻醉藥改良最經典的教學案例。2018年，鑒于可卡因不可替代的麻醉優點，被FDA批準為口腔和鼻腔外科手術的局麻藥。
1917年，Robinson利用丙酮二羧酸（OGA）合成托品酮的一鍋法反應是寫入教科書中天然產物全合成的第一個經典案例，長久以來被大多科學家堅信為仿生合成。2019年，本課題組從茄科植物中鑒定出催化OGA形成的聚酮合酶，為Robinson的化學合成是仿生合成提供了直接的證據（ Nat. Commun. , 2019 , 10 , 4036.）。今年，黃勝雄課題組從古柯科植物中再次鑒定出催化OGA形成的聚酮合酶，而OGA可與 N -甲基吡咯鎓離子自發縮合形成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸（MPOA），作為可卡因托品烷骨架的形成前體（ Nat. Commun. , 2022 , 13 , 4994.）。
在古柯中，已報道的同位素前體標記實驗顯示：4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸甲酯（MMPO）可插入到可卡因中?；诖?， 化學家們 提出了盛行的可卡因托品烷骨架形成假說：MMPO作為可卡因的生物合成中間體，其經氧化環化后形成甲基芽子酮（即MPOA先甲基化，后氧化，圖1A）。為了驗證這一猜想，黃勝雄課題組克隆和表達了古柯中大量的甲基轉移酶和氧化酶，但都無法有效地催化MPOA甲基化生成MMPO，以及催化MMPO氧化環化為甲基芽子酮（methylecgonone），故而對盛行的可卡因托品烷骨架形成假說提出了質疑。
圖1A. 可卡因托品烷骨架合成途徑；圖1B. 經典的Robinson托品酮化學全合成（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
隨后，黃勝雄課題組大膽地提出了另一種托品烷骨架形成假說：MPOA先氧化為極其不穩定的芽子酮（ecgonone），而后甲基化為甲基芽子酮（圖1A）。為了驗證這一猜想，在煙草中同時表達候選的氧化酶和甲基轉移酶被認為是最佳的篩選方式。當氧化酶CYP81AN15和甲基轉移酶MT4共表達時，發現喂養的MPOA被轉化為甲基芽子酮，說明這兩個酶一起工作就能合成甲基芽子酮，從側面也說明了新提出的大膽假設的正確性。為了更加明確氧化酶CYP81AN15和甲基轉移酶MT4的功能，對酶CYP81AN15和MT4進行體外逐步反應是驗證該假設最直接和有效的實驗證據。但是，怎么獲取和檢測不穩定的芽子酮產物是最大的難題。作者仔細分析了Robinson百年前的經典托品酮合成的機制：丁二醛與甲胺經過兩次類Mannich環化后形成的潛在中間體是一個具有托品烷骨架的二酸，該二酸脫羧一次后就是芽子酮，再次脫羧后形成托品酮（圖1B）。隨后作者溫和地重復并處理了Robinson的經典托品酮化學反應，通過LC-MS檢測到了二酸中間體和芽子酮中間體，證實了其反應機制和反應中間體。隨后通過溫和地處理Robinson的經典托品酮合成反應，分離純化并首次通過NMR表征了不穩定的芽子酮標準品。進一步通過體外酶促反應顯示：甲基轉移酶MT4可催化芽子酮甲基化生成甲基芽子酮，而溫和地處理氧化酶CYP81AN15氧化MPOA的酶反應，作者首先檢測到的是芽子酮，隨著時間的推移芽子酮自發脫羧生成托品酮。故而確證了作者大膽的假設并糾正了長期存在的但不正確的MPOA先甲基化后再氧化的猜想，最終闡明了可卡因托品烷骨架的形成過程（圖1A）。
在可卡因的生物合成中，其托品烷骨架是具有光學手性的，但OGA與 N -甲基吡咯鎓離子自發縮合而成的MPOA ( 3 )卻是消旋體。因此，對氧化酶CYP81AN15和甲基轉移酶MT4的底物手性選擇性進行表征，發現（圖2）：氧化酶CYP81AN15只催化 S -MPOA ( S -3 )氧化為(+)-芽子酮( 7 )；甲基轉移酶MT4只催化(+)-芽子酮( 7 )甲基化為(+)-甲基芽子酮( 5 )。故而解決了可卡因生物合成路徑中從消旋MPOA到手性托品烷骨架形成的疑惑。
圖2. 可卡因中托品烷骨架的生物合成途徑（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
基于以上研究結果，利用氧化酶CYP81AN15和甲基轉移酶MT4，以及四個已鑒定的功能酶（PMT1, PKS1, MecgoR和CS）在煙草中組建了可卡因最簡生物合成路徑，最終實現了可卡因的從頭合成（圖3），這標志著一條接近完整的可卡因生物合成途徑的揭示。該研究結果也預示著在不久的將來可以通過合成生物學在酵母或大腸中實現可卡因的異源生產。
圖3. 可卡因生物合成路徑在煙草中從頭構建（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）
總結
中國科學院昆明植物研究所黃勝雄課題組對氧化酶CYP81AN15和甲基轉移酶MT4的發現及功能表征，糾正了長期存在的但不正確的可卡因托品烷骨架形成的猜想，解決了可卡因托品烷骨架構建的世紀難題，實現了可卡因在煙草葉片中的生產；其中，作者巧妙的通過Robinson合成托品酮反應制備芽子酮標準品，用于檢測和驗證氧化酶CYP81AN15催化產物及功能；此外，Robinson合成托品酮的反應中芽子酮中間體的分離再次闡明了經典托品酮化學全合成的仿生合成之美。
文獻詳情：
Yong-Jiang Wang, Jian-Ping Huang, Tian Tian, Yijun Yan, Yin Chen, Jing Yang, Jianghua Chen, Yu-Cheng Gu, Sheng-Xiong Huang*. Discovery and Engineering of the Cocaine Biosynthetic Pathway. J. Am. Chem. Soc . 2022 , https://doi.org/10.1021/jacs.2c09091
